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    荧光定量PCR的技术原理和化学方法

    将荧光基团加入到PCR反应体系中,通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现,再根据标准曲线定量分析未知模板的方法,即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中,实时检测全程PCR扩增过程,按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。


    技术原理

    混合模板DNA和有荧光素的Taqman探针,遵守聚合酶链反应规律使高温变性,低温复性,适温延伸的热循环完成,切断和模板DNA互补配对的Taqman探针,荧光素在反应体系中游离。荧光在特定光激发下发出,被扩增的目的基因片段随着循环次数的增加呈指数级增长,Ct值根据实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度求取出来,同时对照多个已知模板浓度的标准品,就能够使待测标本目的基因的拷贝数得出。


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    荧光化学分方法

    实时荧光定量常用的荧光化学分为有Tag Man探针法和SYBR Green I法两类。


    1.TaqMan探针法

    TaqMan 探针法是具有高度特异性的定量PCR技术。它的工作原理为有一对 PCR 引物和一条探针存在于PCR 反应体系中,有荧光淬灭基团存在于3′ 端标记,有报告基团存在于探针的5′ 端标记,探针仅和模板特异结合,两条引物之间是其结合点。因此信号仪器搜集不到,伴随反应的进展,Taq酶遇到探针,探针在外切核酸酶的活性的作用下被切断,从而造成淬灭基团不能吸收基团的荧光能量,从而使荧光信号产生,所以模板 DNA 的拷贝数取决于信号的强度。


    2.SYBR Green I法

    SYBR Green I为一种具有绿色激发波长的染料,其发射波长最大约为 520 nm,最大吸收波长约为 497 nm,能够结合所有的双螺旋小沟区域。由于处于游离状态,SYBR Green I发出的荧光较弱,然而其结合双链 DNA之后,就会使得荧光大大增强,

    荧光信号的增加完全同步PCR 产物的增加。这个方法的优点是其能够对所有dsDNA 序列的扩增进行监测,有着比较简单的检测方法和比较低廉的成本,但是也正是因为荧光染料能够结合所有的dsDNA 。那么非特异性扩增产物和引物二聚体也能与染料结合,使荧光信号产生,导致实验结果假阳性,所以探针法的特异性要比该方法的特异性要更高。由于和目标产物相比较,非特异性产物和引物二聚体的变性温度要更加的低,因此,能够在可以在熔解曲线反应过程中,信号可以通过软件分析仪器来收集从而鉴别。


    2019-07-11 17:51:15 浏览次数:231次